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Última revisión: 2026-04-28. Cuando una afirmación depende de un estudio concreto, se describe el estudio en lugar de exagerarlo.
Las muestras se cubrieron con aceite mineral ligero, después se calentó a 600 °C durante 4 minutos para la primera ronda de la síntesis de ADN. Los ciclos posteriores consistieron en una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 92 °C y una etapa de síntesis de la hibridación del cebador y el ADN combinado a 60 °C durante 4 minutos. La secuenciación directa de los productos de PCR fue como se describió anteriormente. En el 2001, se propuso por un grupo de investigadores que para la identificación de beta-talasemia, las muestras de sangre fueran conservadas en EDTA, así como la toma de muestras de vellosidades coriónicas o de fluido (CVS) se obtuviera de seleccionados al azar de pacientes diagnosticados clínicamente con beta-talasemia menor. Que se extrajera el ADN de las muestras con el fin de llevar a cabo una PCR-ARMS. Después de la extracción del ADN, las reacciones de PCR se establecieron en dos tubos separados para cada muestra. Un tubo de ensayo para la amplificación del cebador de ARMS normal y el segundo para la amplificación del cebador de ARMS mutante. Actualmente, el método propuesto para preparar y realizar un Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR es el siguiente:
Fuentes: es.wikipedia.org
Preparar una mezcla de reacción (4 ml) que comprende de: 0,5 ml de 10x de la solución amortiguadora de PCR ARMS, 1,25 ml de 1,35 mM de la mezcla de dNTPs y 2,65 ml de agua destilada estéril Poner 20 µl de la mezcla de reacción en un tubo de PCR de 0.5 mL. Añadir 1 µl de cada cebador (1 unidad de DO / ml). Añadir 0,05 ml de Taq ADN polimerasa (5U / l). Cuando se realiza más de una prueba, el cebador y la enzima se pueden mezclar juntos en un tubo separado antes de la adición a la mezcla de reacción. Esto disminuye los errores de pipeteado cuando se utilizan grandes cantidades. Añadir 1 µl de ADN genómico (100 ng / l). Superposición con 25 µl de aceite mineral. Mix, centrífuga y poner en el termociclador. Amplificar durante 25 ciclos como sigue: 1 min a 94 °C / 1 min a 65 °C / 1,5 min a 72 °C con un periodo de extensión final de 3 minutos a 72 °C después del ciclo número 25. Retirar los tubos del termociclador y añadir 5 µl de colorante azul. Mezclar y centrifugar. Cargar una alícuota de 20 µl en un gel de agarosa al 3% y correr a 100 V durante aproximadamente 45 min en TBE. Teñir el gel en una solución de bromuro de etidio (0,5 mg / ml) durante 15-30 minutos Visualizar bandas en una caja de luz UV (312 nm) Fotografiar con un sistema de cámara electrónica o una cámara Polaroid CU-5 equipado con un filtro naranja ( por ejemplo Wratten 22A). Para la T-ARMS-PCR se hizo lo siguiente: ADN genómico fue extraído de 0,2 ml de muestras de sangre periférica frescas mediante el uso de la WizardH Genomic DNA Purification Kit (Promega) según las instrucciones del fabricante.
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muestras de ADN extraídas tenían una concentración final que oscila desde 55 hasta 365 ng / mL. Para superar las limitaciones de los métodos estándar multiplex PCR Arms- T, el método propuesto se ha optimizado en términos de diseño de la cartilla, las condiciones de los ciclos de PCR y en la utilización de cebadores quiméricos y estrategia de TSP, tal como se describe en nuestros informes anteriores en la detección del virus de la gripe de pies y manos y la boca humana asociada agentes patógenos. Se utilizaron un total de 24 cebadores quiméricos cada uno consiste en una secuencia específica de gen con una secuencia de etiqueta universal en el extremo 59. Las porciones de genes específicos de los primers fueron diseñados de acuerdo con los requisitos de la T-ARMS-PCR. La especificidad de los cebadores específicos de alelo es conferido por la identidad del terminal 39 nucleótidos ya sea con el de tipo salvaje o el alelo mutante, la especificidad se incrementa por la introducción de una falta de coincidencia deliberada en la posición -1 de la 39-terminal. Un par de cebadores universales y seis juegos de T-Arms- PCR cebadores quiméricos fueron utilizados para la amplificación. Las secuencias de cebadores detalladas y las concentraciones de trabajo para cada SNP fueron enumerados. El genotipado de los polimorfismos ensayados se realizó mediante amplificación por PCR multiplex y análisis de fragmentos.
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Seis juegos de cebadores T- ARMS-PCR para la amplificación de doce fragmentos de diferentes tamaños se combinaron en un solo 20 ml de volumen de reacción, que también contenían 10 ml de mezcla maestra kit Qiagen Multiplex PCR, 50-100 ng de ADN genómico, y las concentraciones de cada cebador optimizado. Multiplex PCR se realizó utilizando Bioer LifePro termociclador. Una PCR (TSP) protocolo interruptor de temperatura optimizada, que utiliza cuatro temperatura de hibridación diferente se realizó como sigue: etapa de desnaturalización inicial de 95 °C de 10 min, 3 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, y72°C durante 45 s, 10 ciclos de 95 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s, y 72 °C durante 45 s, 20 ciclos de 95 °C durante 30 s, 68 °C durante 30 s, y 72 °C para 45 s, 15 ciclos de 95 °C for 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 45 s, seguidos por un ciclo final de extensión a 72 °C durante 10 min, y después se deja enfriar a 4 °C. Los productos de PCR múltiplex se separaron por ADN QIAxcelH cartucho de gel de alta resolución (Qiagen) en el sistema de QIAxcel (Qia- gen). ADN Tamaño de marcador de 25 a 450 pb (Qiagen) y alineación de marcador 15 pb / 500 pb (Qiagen) se utilizaron en cada QIAxcel se ejecuta y se determinó el tamaño de los productos mediante el software ScreenGel (Qiagen). Debido a que cada uno de los amplicones era de una longitud diferente, se detectaron los alelos sobre la base de los patrones de tamaños de pico. Un total de 186 muestras también fueron secuenciados en paralelo con un ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, EE.
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